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常用的免疫組化染色方法很多，有直接法和間接法。直接法是將酶或熒光素等標(biāo)記在第一抗體上，然后用該被標(biāo)記的第一抗體與組織細(xì)胞中的抗原結(jié)合，即可以顯色或在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；

間接法是將標(biāo)記物標(biāo)記在第二抗體或第三抗體（復(fù)合物）上，其方法是先將特異性的第一抗體與組織細(xì)胞中相應(yīng)的抗原結(jié)合，再將被標(biāo)記上標(biāo)記物的第二抗體與第一抗體結(jié)合，最后用顯色劑顯色或在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

如果標(biāo)記物是標(biāo)記在第三抗體（復(fù)合物）上，則第二抗體與第一抗體結(jié)合后，再用被標(biāo)記上標(biāo)記物的第三抗體（復(fù)合物）與第二抗體結(jié)合，最后用顯色劑顯色或在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

常用的EPOS一步法屬于直接法，EnVision二步法、PAP/APPAP法、LSAB（S-P）法、SABC法、和CSA法等屬于間接法。相對來說直接法特異性高，敏感性低，而間接法則敏感性高，特異性低。

過氧化物酶抗過氧化物酶（peroxidaes anti-peroxidaes，PAP）法屬于非標(biāo)記抗體法，該方法的主要技術(shù)是通過制備具有高特異性的抗過氧化物酶抗體，并在抗酶抗體中加入過量的過氧化物酶，使過氧化物酶充分結(jié)合在抗酶抗體上形成可溶性的PAP復(fù)合物。

用于制備PAP復(fù)合物時免疫的動物主要是鼠和兔，所以制備出的PAP復(fù)合物分別為鼠（mouse）PAP復(fù)合物和兔（rabbit）PAP復(fù)合物。

PAP法為三步法，除了PAP復(fù)合物外，還需要有第二抗體，該第二抗體中的IgG有兩個Fab片段，一個與特異性第一抗體結(jié)合，另外一個與PAP復(fù)合物結(jié)合，最后通過PAP復(fù)合物上的酶參與顯色反應(yīng)而形成有顏色的不溶性沉淀物。

由于第二抗體中IgG的兩個Fab片段是相同的，所以，與之結(jié)合的第一抗體和PAP復(fù)合物中的抗酶抗體是來源于同源動物。

在檢測抗原時要注意抗體的配對，如第一抗體是鼠抗，第二抗體應(yīng)該為抗鼠的IgG，與鼠PAP復(fù)合物結(jié)合。同樣如果第一抗體是兔抗，第二抗體為抗兔的IgG，與兔PAP復(fù)合物結(jié)合。如果配對錯了，抗體之間就連接不上，染色就失敗。

此外，顯色劑也要與PAP復(fù)合物上的酶相配對，PAP復(fù)合物上結(jié)合的酶為過氧化物酶，顯色底物用DAB或AEC。

 

 

 

 

堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase，APAAP）法也屬于非標(biāo)記抗體法，該方法的主要技術(shù)也是通過制備具有高特異性的抗堿性磷酸酶抗體，并在抗酶抗體中加入過量的堿性磷酸酶，使堿性磷酸酶充分結(jié)合在抗酶抗體上形成可溶性的APAAP復(fù)合物。

APPAP法的原理、操作步驟等和PAP法基本相同，所不同的是在染色操作過程中不需要用H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，所用的顯色劑為固藍(lán)、固紅或BCIP/NBT等。

 

 

 

 

卵白素-生物素復(fù)合物（avidin biotin complex，ABC）法屬于親和免疫組織化學(xué)技術(shù)，該方法是根據(jù)卵白素和生物素具有高度親和力的生物學(xué)特性，用生物素與過氧化物酶結(jié)合獲得生物素化過氧化物酶，生物素化過氧化物酶再和加入的卵白素形成卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物即ABC復(fù)合物。

ABC法為三步法，第二抗體為生物素化的IgG，其中的Fab片段和第一抗體結(jié)合，生物素和ABC復(fù)合物中的卵白素結(jié)合，最后通過ABC復(fù)合物上的過氧化物酶參與顯色反應(yīng)而形成有顏色的不溶性沉淀物。由于卵白素和生物素的親和力極強(qiáng)，所以ABC法較敏感，比PAP法敏感20～40倍。

 

 

 

 

標(biāo)記抗生物素蛋白鏈菌素-生物素（lablled streptavidinbiotin）法和ABC法相似，不同處是在第二抗體之后ABC法用ABC復(fù)合物而LSAB法用標(biāo)記了過氧化物酶的抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin，SA）。SA是從鏈霉菌屬蛋白分離出來的一種蛋白質(zhì)，它僅標(biāo)記了過氧化物酶而本身沒有與生物素連接，生物素是連接在第二抗體上。

由于SA分子量較小，ABC復(fù)合物分子量大，因而SA穿透組織的能力比ABC復(fù)合物大，反應(yīng)速度快。SA有兩個和生物素親和力極高的結(jié)合點，其本身沒有連結(jié)生物素，可以與第二抗體上的生物素連結(jié)。這樣，SA比ABC復(fù)合物更容易與第二抗體上的生物素結(jié)合，因而SA的敏感性比ABC高，反應(yīng)所需的時間比ABC短。

 

 

 

 

以上就是前四種種常用的免疫組織化學(xué)染色方法的簡介。如在實驗中遇到困難，也可以選擇Leica全自動免疫組化染色儀來協(xié)助您。